【上海液質(zhì)檢測】-植物組織中糖、淀粉和纖維素含量的測定_Mw9q7
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一、原理:
植物組織中的
還原糖
、蔗糖等在
80%的乙醇溶液中溶解,而淀粉及大部分蛋白質(zhì)沉淀,當用4.6 molL -1
高氯酸
(HCIO4)溶解淀粉后,也可使蛋白質(zhì)、纖維素等沉淀,再以0.1 molL -1NaOH溶解蛋白質(zhì)、熱水和丙酮除去果膠和脂質(zhì)后,剩余的沉淀可用于纖維素含量的測定。將上述各部分分離后,再選用適當?shù)姆椒ǚ謩e測定。

本實驗選用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖,蔥酮法測定
可溶性總糖
、淀粉和
纖維素
含量。其原理分述如下
:
1.還原糖測定:各種單糖和麥芽糖等還原糖在堿性條件下,與3,5-二硝基水楊酸試劑共熱時,可將黃色的3,5-二硝基水楊酸還原為棕紅色的氨基化合物。在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液顏色的深淺成正比。利用分光光度計在540nm波長下測定反應(yīng)液的吸光度,查對標準曲線或利用一元回歸方程計算出還原糖的含量。
2.蒽酮比色法原理:糖(包括可溶性糖和多糖)在濃H2SO,作用下脫水形成糠醛,再進一- 步脫水形成環(huán)后,產(chǎn)生糠醛衍生物,可與蒽酮脫水縮合而成藍綠色物質(zhì)。在620 nm處有最大吸收,而且在10~100 μg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖含量呈正比。此法適用于己酮糖和己醛糖的測定。
加熱時間和溫度影響蒽酮反應(yīng)的顏色深淺,因此操作中應(yīng)保持反應(yīng)條件的一致。同時樣品中含有較多的色氨酸時反應(yīng)不穩(wěn)定。
二、儀器設(shè)備
三、試劑
1.80%乙醇溶液。
2. 9.2 molL -1
及
4.6 molL -1
高氯酸
(HCIO4)。
3. 0.1 molL -1 NaOH溶液。
4.60% H2SO4
。
5.葡萄糖標準液:稱取分析純葡萄糖(預(yù)先于80°C下烘干至恒重)100mg,溶于蒸餾水中,定容至100mL,即為1mgmL -1
標準原液
,用時稀釋10倍,即為100μgmL -1
標準液。
6.蒽酮一硫酸試劑:稱取0.2g蒽酮,和1.0g硫脲(抗氧化劑)置燒杯中,緩緩加人100mL濃硫酸,攪拌溶解后應(yīng)呈淡黃色透明溶液,隨配隨用。
7. 3,5-二硝基水楊酸試劑:精確稱取1g 3,5-二硝基水楊酸,溶于20mL 2molL -1NaOH溶液中,加入50mL蒸餾水,再加入30g酒石酸鉀鈉,待溶解后用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞,勿使CO2
進入。若溶液渾濁可過濾后使用。
8.纖維素標準液:準確稱取纖維素100mg,在冰浴下加人60~70mL預(yù)冷的60%H2SO4,在0~2°C下水解12h;然后用60% H2SO4
稀釋至
100mL刻度,搖勻。將此液在冰浴下稀釋10倍,即可100μgmL -1
之標準液。
四、材料
過100目篩的植物干樣品或新鮮植物組織。
五、方法步驟
1.提取分離
(1)稱取植物干樣0.5000g于10mL離心管中,加入5~6mL80%乙醇溶液,80°C水浴30min ,其間不時攪拌。用少量80%乙醇沖洗玻璃棒,并將溶液冷卻到室溫后3500g下離心10min,上清液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中;再向沉淀中加入5-6mL80%乙醇,如上法重復(fù)浸提2次,將上清液合并于25mL容量瓶中,并定容至刻度。該提取液用于測定還原糖和可溶性糖。
(2)向沉淀中加人2 mL蒸餾水,在沸水浴中糊化15 min,冷卻后加人2 mL 9.2 molL -1HCIO攪拌15 min后,加蒸餾水4mL,混勻,在4000g下離心10 min,上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中。再向沉淀中加人2 mL 4.6 molL -1HCIO, ,攪拌提取15 min,加入5 mL蒸餾水,混勻后離心10min,合并上清液,用蒸餾水洗沉淀2次,每次5~6mL,合并上清液并用蒸餾水定容到刻度。該提取液用于測定淀粉。沉淀用于纖維素的測定。
(3)依次用0.1molL -1NaOH溶液、熱蒸餾水和丙酮等各洗沉淀2~3次,以除掉蛋白質(zhì)、果膠和脂質(zhì)等雜質(zhì)。每次洗15min,溶劑用量5-6mL,離心后棄去上清液;沉淀用于纖維素含量測定。
(4)向洗滌后的沉淀中加人5~6 mL 60%的H2SO4
溶液
,攪拌均勾后置4°C冰箱中冷水解12h以上,取出后于4000g下離心15 min,上清液轉(zhuǎn)人25 mL容量瓶中;再向沉淀中加入5-6 mL 60%的H2SO4
溶液
,重復(fù)提取2次,每次15 min,將上清液合并于25 mL容量瓶中,并用60%H2SO4
定容至刻度,用于粗纖維含量測定。
2.測定
(1)還原糖的測定
①制作標準曲線:取7支25mL具塞刻度試管編號,并按下表加入各種試劑。
加完試劑后搖勻,在沸水浴中加熱5 min,取出后立即用流水冷卻,加蒸餾水定容至20 mL。以1號管作為空白調(diào)零,在540 nm波長下比色測定。以吸光度為縱坐標,葡萄糖含量為橫坐標,繪制或求出標準曲線。
②樣品中還原糖含量的測定:吸取可溶性糖提取液2mL,置10mL離心管中(每個樣品重復(fù)3次),在沸水浴上蒸干,準確加人10~20 mL蒸餾水(加水體積依還原糖含量而定),充分攪拌使糖溶解,離心,取2 mL上清液(剩余上清液用于可溶性糖測定)于試管中,
加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑,與標準曲線同法測定之。
③結(jié)果計算
式中,C:從標準曲線上查得或計算出來的樣品測定管中葡萄糖含量(mg);V.:樣品提取液總體積(mL);V, :測定時取樣體積(mL);W :樣品干重(mg)。
(2)
可溶性總糖的測定
①制作標準曲線:取6支25mmX180mm試管編號,并按下表加入各種試劑。
在加蒽酮-H2SO4
試劑時
,最好將試管放在冰水浴中,并沿管壁緩緩加人,待全部加完后再混勻。將以上標準管和樣品管同時放入100 C水浴中準確加熱10 min,取出后用自來水冷卻至室溫后測定620 nm波長下(光徑0.5 cm)吸光度。以吸光度為縱坐標,糖溶液濃度為橫坐標,繪制標準曲線。
②樣品測定:取上述測定還原糖剩余的樣品液適當稀釋(10~50倍)后取2mL與標準管同樣操作,記錄620nm波長下的吸光度。
③結(jié)果計算
式中,C:從標準曲線上查得樣品測定管中含葡萄糖的量(μg);n:稀釋倍數(shù);1 000:換算系數(shù),1mg=1000μg;其他符號意義與還原糖計算中相同。
(3)淀粉含量的測定:取上述淀粉提取液2 mL于25 mmX180 mm大試管中,用測定可溶性糖的方法測定之。結(jié)果計算如下。
式中,0.9:葡萄糖換算成淀粉的系數(shù);其余符號與可溶性糖計算相同。
(4)纖維含量的測定
①蒽酮-H
2SO4
法:按下表加入各種試劑并制作標準曲線:
以上標準管加完試劑后,先不搖動,再吸取2 mL水解液(重復(fù)3次),放入另一試管中,待全部加完蒽酮硫酸試劑后搖動混合,與測定淀粉同樣的方法進行操作,并按下式進行計算:
式中,C:從標準曲線上查得樣品管中的纖維素含量(μg);其余符號與可溶性糖計算相同。
②重量法:將用丙酮洗滌2次脫脂后的沉淀,在105°C下烘干至恒重w],再將稱重后的粗纖維置500°C馬弗爐中灰化3 h,冷卻后稱取恒重(W2)。
式中,W:樣品干重(g) ;W1
、
W2:分別代表前后兩次恒重(g)。
注意事項
1.在測定新鮮樣品時,用于提取可溶性總糖的乙醇濃度可以根據(jù)材料的含水量換算后適當提高。
2.在可溶性糖(包括淀粉、纖維素)測定中,加人蒽酮-H2SO4
試劑必須沿著管壁緩慢進行,以免樣品中可溶性糖提前反應(yīng)顯色
,影響實驗結(jié)果。
3.所有樣品測定管必須重復(fù)3次以上。
